生物化學實驗基本技術：破碎技術

除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質與酶以外，對于細胞內(nèi)或多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。

1.機械破碎

（1）研磨

研磨是將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎，這種方法比較溫和，適宜實驗室使用。工業(yè)生產(chǎn)中可用電磨研磨。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法。

（2）勻漿

勻漿這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min-20000r/min 的內(nèi)刀式組織搗碎機（即高速分散器）將組織的細胞打碎，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉10秒-20秒，停10秒-20秒，可反復多次。

（3）膠體磨

膠體磨的基本原理是流體或半流體物料在離心力的作用下，強制通過高速相對運動的定齒與動齒之間，使物料受到強大的剪切力，磨擦力、高頻振動和高速旋渦等復雜力等作用，有效地被粉碎、乳化、均質、混合，從而達到精細超微的效果。定轉子間的高速相對運動是使膠體磨工作獲得物理微細度的主要條件，只有提高磨盤的精密度與線速度，才能達到良好的加工效果。

2. 物理破碎

（1）壓榨

壓榨是一種溫和的、*破碎細胞的方法。在1000×10⁵Pa-2000×10⁵Pa 的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將*破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法，但儀器費用較高。

（2）冷熱交替

冷熱交替是在90℃左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎，細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此技術。

（3）反復凍融

反復凍融是將待破碎的細胞冷至15℃-20℃，然后放于室溫（或40℃）迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞破碎。

（4）超聲波

超聲波是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關。使用時注意降溫，防止過熱。

3.化學與生物化學破碎

（1）有機溶劑

有機溶劑是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，

可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此技術也可以與研磨法聯(lián)合使用。

（2）自溶

自溶是將新鮮的生物材料存放于一定的pH 和適當?shù)臏囟认拢毎Y構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來，此法稱為自溶法。該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也有可能會把某些要提取的有效成分分解。

（3）溶脹

溶脹是在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。

（4）酶解

酶解是利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解，釋放出細胞內(nèi)含物，酶解破碎適用于多種微生物。例如從某些細菌細胞提取質粒DNA 時，可采用溶菌酶（來自蛋清）破細胞壁，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶（來自蝸牛），將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液（pH=5.4）中，加1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂，如同時加入0.2%疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨聯(lián)合使用